您的位置: 首頁 > 技術 >

HaloTag® 技術

簡介

HaloTag®是活細胞和固定細胞多色細胞成像實驗的首選系統。這種多功能標簽可以特異地與多種配體共價結合,能夠在體內體外方便地對標簽蛋白加熒光基團和純化。

HaloTag®也能提高蛋白的表達量和可溶性,因此可以用于許多下游應用

 

技術

HaloTag®標簽蛋白是一種脫鹵素酶的遺傳修飾衍生物,可與多種合成的HaloTag®配體有效地共價結合。這個分子量為33KDa的單體蛋白能融合在重組蛋白的N端或C 端,并在原核或真核系統中表達。

 

與OmicsLink™即用型表達克隆結合使用

GeneCopoeia提供帶有HaloTag®、CMV啟動子、新霉素篩選標記的哺乳動物細胞和慢病毒的表達載體。 可以訂購帶有HaloTag®標簽的20,000多種人和15,000多種小鼠的基因。

 

特異性

HaloTag®融合蛋白能特異地與報告子和配體共價結合,可以檢測和固定標簽蛋白。點擊查看GeneCopoeia可以提供的基因和配體列表

 

嚴格的質檢和質量保證

OmicsLink clone collection里的所有ORF表達克隆源于驗證過的全長cDNA克隆或高質量的人源cDNA組織文庫。

寄送之前,GeneCopoeia對所有的克隆進行了嚴格的質檢過程。

  • 所有的ORF經過全長測序
  • 通過PCR驗證序列長度
  • 通過酶切驗證質粒的正確性

載體信息

帶有HaloTag®的表達載體列表

Vector Promoter  Host cell Selection marker Tag Protease site
pReceiver-Lv64 CMV Stem/primary cell Neomycin N-HaloTag Tev protease
pReceiver-Lv65 CMV Stem/ primary cell Neomycin C-HaloTag Tev protease
pReceiver-M49 CMV Mammalian Neomycin N-HaloTag Tev protease
pReceiver-M50 CMV Mammalian Neomycin C-HaloTag Tev protease

 

 

HaloTag ORF cDNA clonesHaloTag ORF cDNA clones

 

圖1. 帶N-或C-端HaloTag®的OmicsLink即用型ORF表達克隆載體 圖

 

How it works

Labeling of HaloTag proteins

圖2. HaloTag®融合蛋白能特異地與報告子和配體共價結合,可以檢測和固定標簽蛋白

應用實例

HaloTag®技術的應用

蛋白定位

過膜或是不過膜的HaloTag®配體都可以標記胞內和膜上的蛋白。這些被標記的蛋白可以使用熒光顯微鏡來觀察 (Figure 1). 不能過膜的熒光染料可用于帶有HaloTag®的膜蛋白的標記

   
Live cells expressing HaloTag? fusion protein labeled with three different ligands  

圖3. 用三個不同配體標記HaloTag® 融合蛋白。  HeLa細胞瞬時轉染HaloTag® pHT2 表達克隆,使用5 μM HaloTag® TMR 配體 (Panel A); 10μM HaloTag® diAcFAM Ligand (Panel B);  25 μM HaloTag® Coumarin Ligand (Panel C).

蛋白共定位

如果加了配體后固定HaloTag®融合蛋白的表達細胞,這些細胞可以進一步使用免疫化學實驗對蛋白進行共定位(Figure 2)。抗 HaloTag® 的多克隆抗體也可以和其他抗體共同使用來進行共定位研究。

   
Fixed cells expressing p65-HaloTag? fusion protein labeled with HaloTag? TMR ligand and an antibody to tubulin  

圖4. 固定表達 p65-HaloTag® 融合蛋白(使用HaloTag® TMR配體和抗體標記)的細胞。HeLa細胞瞬時轉染p65-HaloTag®后使用TMR配體染色在37℃染色15分鐘。隨后使用1 μg/ml小鼠Anti-βIII微管蛋白固定細胞,使用Alexa Fluor 488-conjugated 二次孵育。 Panel A: TMR fluorescence. Panel B. Alexa Fluor-488 fluorescence. Panel C: Overlaid Alexa Fluor™-488 and TMR fluorescence and transmitted light. Panel D: Overlaid AlexaFluor-488 and TMR fluorescence. Please refer to Promega’s manual TM260 for this application.

 

 

 

 

蛋白-DNA相互作用

起固定作用的配體(例如HaloLink™ Resin) 可以將HaloTag® 融合蛋白交聯到DNA。這樣就不用像經典的染色體免疫共沉淀(ChIP)實驗那樣使用抗體。詳情請參考Promega #TM075的使用說明。

   

使用多重脈沖追蹤標記研究蛋白轉運

使用不同的熒光配體可以在不同時間標記活細胞內的HaloTag®融合蛋白(Figure 3).詳情參看Promega TM260使用說明。

   
Spatial and temporal separation of proteins using HaloTag? technology  

圖5. 使用HaloTag®技術示蹤蛋白。標記細胞0小時和12小時的顯影顯示這些標記的蛋白從細胞質移動到細胞膜。詳細信息請參看 Svendsen, S., et al., (Promega Notes 95 (2007) 16–19).

蛋白富集, SDS-PAGE和western blot分析

使用生物素配體和固定的親和素可以用于HaloTag®融合蛋白的純化、酶切驗證、質譜分析或轉錄后修飾。使用熒光配體標記的HaloTag® 融合蛋白可以通過SDS-PAGE和 western blot分離(Figure 4).

   
Fast, efficient and highly specific labeling of the HaloTag? proteins expressed in mammalian cells  

圖6. 快速、高效、特異地標記哺乳動物細胞表達的HaloTag®蛋白。泳道1–6為CHO-K1對照細胞,泳道7–12為瞬時轉染HaloTag® pHT2表達克隆的細胞,使用5 μM HaloTag® TMR Ligand  在37°C分別孵育0.5、1、2、5、15和30分鐘.蛋白使用SDS-PAGE分離,通過Hitachi FMBIO® 熒光掃描儀分析。

 

HaloTag®是Promega公司專利產品,本公司獲得授權使用,此頁面的所有數據的使用都得到了Promega的允許。

相關產品

Reporter and Affinity HaloTag® Ligands

HaloTag®配體眾多,都是小分子化學物,能夠在體外或體內與HaloTag®蛋白共價結合。這些配體由兩個關鍵組分組成:一個通用的HaloTag®反應聯結子,結合HaloTag®蛋白;另一個是功能基團,例如熒光染料或親和媒介。

 HaloTag®融合蛋白能特異地與報告子和配體共價結合,可以檢測和固定標簽蛋白

HaloTag®配體和Anti-HaloTag抗體

Buy Catalog#  Ligand  Unit Qty  Excitation Maximum  Emission Maximum  Application Price ($USD)
G8272 HaloTag® diAcFAM Ligand 30μl at
1mM
1 494nm 526nm Intracellular protein labeling 489
G8251 HaloTag®  TMR Ligand 30μl at
5mM
1 555nm 585nm Intracellular protein labeling 489
G8581 HaloTag® Coumarin Ligand 30μl at
10mM
1 353nm 434nm Intracellular protein labeling 475
G9281* Anti HaloTag® pAB 200μg, 1mg/ml 1     Labeling after fixing or protein enrichment 225

 

 

*G9281必須和ORF表達克隆配套購買

 

HaloTag相關產品可以從Promega購買

Catalog #  Ligand  Excitation Maximum  Emission Maximum  Application
G2801 HaloTag® Oregon Green® Ligand 496nm 516nm Intracellular protein labeling
G1001 HaloTag® Alexa Fluor™ 488 Ligand 494nm 517nm surface membrane protein labeling
G8281 HaloTag® Biotin     Protein interaction and/or enrichment
G8591 HaloTag® PEG-Biotin     Protein enrichment
G1911 HaloLink™ Resin     ChIP Assay

 

點擊了解即用型ORF克隆 ,提供大腸桿菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母和麥胚無細胞表達克隆載體

瀏覽 www.promega.com 獲取HaloTag®相關產品信息

HaloTag®是Promega公司專利產品,本公司獲得授權使用